MILLIPOREECL化學(xué)發(fā)光底物是指在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并zui終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。在發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光底物有以下幾類。

　　

　　1．氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是zui常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（luminol，5'-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下：

　　

　　魯米諾反應(yīng)結(jié)構(gòu)式

　　

　　魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。異魯米諾衍生物ASEI和ABMI等也是常用的標記物。

　　

　　2．吖啶酯（acridiniumester，AE）類類發(fā)光劑不需催化劑的存在，在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。反應(yīng)式如下：

　　

　　電化學(xué)發(fā)光原理

　　

　　上式反應(yīng)迅速，在1～5s內(nèi)即可完成；具有背景低、信比高的優(yōu)點，其檢測極限可達5×10-9mol，發(fā)光量與AE濃度呈良好的線性反應(yīng)，是一類的標記物。

　　

　　3．電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）反應(yīng)在電極表面進行。發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]，另一反應(yīng)物為三丙胺（TPA）。在陽電極表面，以上兩化學(xué)物質(zhì)可同時失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)（圖2）。二價的Ru(bpy)32+被氧化成三價Ru(bpy)33+，TPA被氧化成陽離子自由基TPA+●，后者失去一個質(zhì)子（H+），成為自由基TPA●，這是一個強還原劑，可將一個電子遞給三價的Ru(bpy)32+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化產(chǎn)物。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*在衰減時發(fā)射一個波長為620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進行，產(chǎn)生許多光子，使信號得以增強。

　　

　　4．MILLIPOREECL化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)品特點

　　

　　靈敏：信號強背景低，所需抗原抗體量少。

　　

　　持久：發(fā)光時間長，可進行反復(fù)曝光，進行結(jié)果優(yōu)化，而不需要重復(fù)Blot。

　　

　　快捷：MILLIPOREECL化學(xué)發(fā)光底物操作簡單方便，且數(shù)秒內(nèi)即可產(chǎn)生強烈信號。

　　

　　定量：使用反射型顯像密度計或者CCD相機掃描已曝光的X光片，可對目的蛋白進行定量。

　　

　　穩(wěn)定：產(chǎn)品有效期長，4℃可保存1年；且曝光后X光片上的印跡不褪色，可使實驗結(jié)果長期保存。